尊龙凯时人胰腺癌细胞HPAFⅡ培养说明书

一、细胞培养条件

尊龙凯时人胰腺癌细胞HPAFⅡ具备贴壁生长特性。其冻存条件为无血清冻存液，培养体系为MEM+10%FBS+1%丙酮酸钠+1%L-谷氨酰胺+1%P/S。首次传代时建议使用1:2的比例。传代后每两天需更换培养基。备注：请使用无菌离心管收集瓶中的培养基，以便进行对比实验。如对比实验效果不理想，建议直接选购尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，应培养至状态良好，然后灌满完全培养液并封闭瓶口，这是运输细胞的最佳方法。首先，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒后，放置于超净台内进行严格的无菌操作。接着，将细胞瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以使细胞状态稳定，然后进行处理。显微镜下观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片进行保存（如40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片则默认收到状态良好。传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，换液后需将瓶盖拧松。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

当细胞未超过80%汇合度时，收集培养液至离心管中，保留5ml完全培养基在37℃、5%CO2的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化液，放在37℃培养箱培养1-2分钟，观察细胞消化情况；若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻微震动培养瓶并加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液以1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，然后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至占据培养瓶80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗一次；
2. 加入约1ml 0.25%胰蛋白酶，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中并在1000rpm下离心5分钟；
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中；
4. 将冻存细胞直接置于-80℃冰箱中。如需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c、细胞复苏

1. 联系液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），快速置于37℃水浴解冻直至冻存管中无结晶，然后用75%酒精擦拭外壁；
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，并在1000rpm下离心5分钟；
3. 弃去上清，重悬于5ml完全培养基中，并接种至T25培养瓶，放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养；
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

部分细胞由于贴壁不牢，运输过程中可能出现细胞脱落，属于正常现象。如脱落较多，可将培养瓶中所有培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟以备对比培养，沉淀部分加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，并加入5ml完全培养基终止反应。再离心、弃上清，并用1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

五、售后条款

尊龙凯时在细胞出现问题时支持重发的情况及标准如下：

1. 运输问题导致的细胞丢失或瓶身破损、漏液等，均可重发。
2. 收到产品48小时内如发现污染，请提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货细胞在静置24小时后，干冰发货细胞复苏后24小时内大部分细胞未存活（需提供真实的细胞状态照片），可重发。
4. 如干冰发货细胞在复苏后24小时及常温发货细胞静置4小时未开封出现污染，支持重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后支持重发。
6. 在收到细胞当天及第2、3天需拍照，若3天内未告知则视为产品合格。4-7天内如有问题，需提供前3天的照片及操作的详细步骤，并与技术人员沟通，如确定为我方责任可重发。反之若判定为双方责任，则需协商处理，或按合同价的50%收费重发。

不予重发的情况包括：

1. 客户自身造成的细胞污染。
2. 因操作不当导致细胞状态不佳。
3. 未使用尊龙凯时推荐的培养体系导致细胞状态不佳。
4. 细胞状态不良且未提供前三天的照片。
5. 细胞在培养过程中经其他处理。
6. 收到后两天内未告知。
7. 具体情况需定制判断。