近年来，液体活检因其低侵入性及可频繁或连续采样的优势，成为追踪肿瘤进展和治疗反应的重要工具。其中，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）作为一种由细胞释放的、具有脂质双层膜结构的生物标志物，因其能够真实地反映活体细胞的状态而愈发受到关注。EV中含有多种内容物，包括脂质、蛋白质和RNA，越来越多的研究发现其在临床应用中的潜力。例如，研究表明EV miRNA生物标志物面板的诊断性能普遍优于单一生物标志物，且EV miRNA在血浆中的诊断价值略高于血清。

针对前列腺癌，研究者通过对患者尿液中miRNA的差异表达分析，发现10种尿液miRNA可作为前列腺癌早期检测的工具。此外，一些研究发现血液中的EV长链RNA表达谱可以作为胰腺导管腺癌的生物标志物，有效地区分健康个体与恶性肿瘤患者。

传统研究中，血液中的cfRNA多采用短读长测序方法，这在解析全长转录本异构体和复杂RNA加工事件上存在显著局限。相比之下，cfRNA中的细胞外囊泡RNA容积更完整，长度更长，采用长读长RNA测序技术可以直接对EV RNA全长转录本进行测序，从而能够发现更多新型RNA异构体，为临床应用提供更高效、准确的价值。

来自尊龙凯时的加州大学圣克鲁兹分校Daniel Kim研究小组也意识到长读长测序的优势，专注于利用该技术进行血液EV RNA的检测，以验证EV RNA在疾病诊断中的作用。他们发现当前的基于DNA的液体活检方法可能会遗漏癌症的早期阶段，癌症的早期诊断对缩短治疗时间并降低死亡率至关重要。

该研究小组通过COMPLETE-seq RNA流程，基于高特异性的膜亲和技术和硅胶膜柱法提取血浆EV RNA，利用纳米孔长读长技术与短读长技术结合的方式进行测序，从而获取EV RNA转录组的全面信息。研究结果显示，重复RNA序列在血液中含量丰富，且可作为疾病特异性诊断生物标志物，该研究成果发表在《Nature Biomedical Engineering》期刊上。

COMPLETE-seq RNA流程中，首先从血浆中提取EV RNA，将其反转录为cDNA后进行文库构建，然后分别进行短读长和纳米孔长读长测序，接着进行基因的差异表达和cfRNA长度分析。长读长RNA测序的结果显示，大多数胰腺癌患者血浆中都发现大量来自重复序列的游离RNA，主要来自SINE元件。

最后，研究小组利用癌症基因组图谱计划（TCGA）中食道癌样本的测序数据，以及GTEX联盟正常样本的数据，探测食道癌特异性的RNA特征，发现“数百个重复衍生的转录本在食道癌中大量且特异性地富集”，这表明重复RNA序列在疾病特异性诊断中的潜力。

这项研究的长读长测序数据显示mRNA的长度可达1337nt，lncRNA为970nt，LINE为1002nt，SINE为368nt，LTR为477nt。这一发现意味着首次真实地识别了这些cfRNA的真正长度。针对健康对照和胰腺癌患者的cfRNA特征分析结果与先前"cfRNA短且易降解"的传统观点截然不同。

在这一过程中，健康和胰腺癌患者的血液样本经处理后分离成血浆，再使用exoRNeasy（QIAGEN）试剂盒提取EV RNA，最后进行cfRNA的长读长和短读长测序。这些长读长测序的数据意味着通过exoRNeasy试剂盒提取得到的EV RNA完整性高，无降解现象。

针对细胞外囊泡RNA的快速分离，exoRNeasy系列试剂盒支持高达4mL的血清、16mL的尿液及32mL的细胞培养上清。快速完成EV特异性分离后，直接在柱上裂解结合QIAGEN经典的硅胶膜技术，高效提取高纯度的总RNA，适用各类RNA的检测与分析。若仅需分离EV，则可选择exoEasy Maxi Kit，基于膜亲和技术，无需超速离心或沉淀，25分钟即可完成细胞外囊泡的特异性分离。

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